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蛋白表達實驗過程可能遇到的常見問題分析

發(fā)布日期：2021-10-18 來源：admin

蛋白表達實驗過程可能遇到的常見問題有哪些呢？我們應該怎么處理呢？

一、蛋白不表達或表達量很低？

1.選擇正確的表達載體和表達菌株

T7啟動子的載體應選用BL21（DE3），BL21（DE3）pLysS，Transetta（DE3）等菌株。非T7啟動子的表達載體應選用BL21表達菌株。

2.嘗試不同的表達載體與菌株

3.表達條件的優(yōu)化

選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖（0.1%-0.5%），可以明顯提高表達量。

較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長的表達時間，一般可以加快表達的速度，促進目的蛋白的積累，從而提高表達量。但可能會降低可溶蛋白的表達量，形成包涵體。

細胞的生長狀態(tài)對蛋白表達有很大的影響，可以通過測量菌液的OD600值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白，應在菌株的對數(shù)生長期（OD600=0.5）進行誘導。

二、目的蛋白大小不正確？

蛋白的結構對判斷分子量大小有一定影響?？梢酝ㄟ^加熱變性蛋白，從而準確判斷蛋白大小。確認蛋白表達是否完整，蛋白是否提前終止表達。若形成二聚體甚至多聚體，可以通過加熱變性蛋白打開二硫鍵（加入DTT、β-ME等還原劑）等手段，破壞次級結構，準確判斷分子量大小。

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